Lockvogel-ACE2-Nanopartikel blockieren den Eintritt von SARS-CoV-2 in Zellen

In einer kürzlich veröffentlichten Studie bioRxiv* Preprint-Server berichteten Forscher, dass Nanopartikel das Eindringen von Coronavirus-2 (SARS-CoV-2) in das schwere akute respiratorische Syndrom verhindern könnten.

Studien: ACE2-Nanopartikel verhindern den Zelleintritt von SARS-CoV-2. Bildnachweis: Kateryna Kon / Shutterstock

SARS-CoV-2, der ursächliche Erreger der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19), dringt in menschliche Zellen ein, indem es über sein Spike (S)-Protein mit dem Angiotensin-Converting-Enzym-2 (ACE2) des Wirts interagiert. Gegen SARS-CoV-2 wurden eine Reihe von Impfstoffen und Behandlungsansätzen entwickelt. Diese Optionen basieren meist auf Antikörpern, die an exponierte Virusproteine ​​binden und deren Eindringen in Zellen verhindern.

Zu den Bedenken bei diesen Ansätzen gehört die Entwicklung des Virus zu neuen Mutantenvarianten, die die Wechselwirkung zwischen dem Virus und dem Antikörper schwächen und dadurch die Wirksamkeit von Impfstoffen und Therapeutika verringern. Beispielsweise weist die neueste Omicron-Variante mit etwa 15 Mutationen in der Rezeptorbindungsdomäne (RBD) des S-Proteins eine erhebliche Immunflucht auf und wirkt sich negativ auf die Impfung oder die therapeutische Wirksamkeit aus.

Darüber hinaus zielen einige Therapeutika auf Proteine ​​ab, die an der viralen Replikation beteiligt sind. Da diese Hemmmechanismen außerdem an Proteine ​​binden, die möglicherweise Mutationen unterliegen, könnten sie dem Virus auch die Flucht ermöglichen. Darüber hinaus können Medikamente, die auf den Replikationsprozess abzielen, ebenfalls Komplikationen verursachen, da ihre funktionelle Aktivität innerhalb der Wirtszelle stattfindet, anstatt den Viruseintritt zu blockieren. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, den ACE2-Rezeptor als therapeutische Intervention und Barriere gegen das Entweichen von Viren zu erforschen.

Die Studie und Ergebnisse

In der vorliegenden Studie konstruierten die Forscher einen Köder oder Nanopartikel, ein auf dem murinen Leukämievirus (MLV) basierendes Trägersystem, pseudotypisiert mit menschlichem ACE2 (hACE2) in voller Länge auf der Oberfläche. Parallel dazu wurden MLVs mit Luciferase-Messenger-Ribonukleinsäure (mRNA) als Kontroll-MLVs etabliert, zusammen mit anderen Kontrollen wie MLVs, die mit S-Proteinen des Wildtyps (WT) SARS-CoV-2, Delta oder der Omicron-Variante pseudotypisiert wurden. Die Wirkung von hACE2-Nanopartikeln auf den Zelleintritt von SARS-CoV-2 wurde mithilfe von Luciferase-Aktivitätsassays untersucht.

Die Morphologie und das Vorhandensein von Pseudoviren nach der Infektion von Vero-E6-Zellen wurden unter Verwendung von Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) verifiziert. Diese Zellen exprimieren endogen ACE2 von afrikanischen grünen Meerkatzen mit einer 100%igen Sequenzidentität mit hACE2. Die Autoren beobachteten S-Proteine, die in Konfigurationen vor und nach der Fusion aus der pseudoviralen Oberfläche herausragten. Sie berichteten, dass der pseudovirale Zelleintritt auf Clathrin-vermittelter Endozytose basierte, was mit dem SARS-CoV-2-Zelleintritt in Abwesenheit von Transmembran-Serin-Protease 2 (TMPRSS2) übereinstimmt.

SARS-CoV-2-Pseudoviren gelangen über den Clathrin-vermittelten endozytotischen Weg in die Zellen.

SARS-CoV-2-Pseudoviren gelangen über den Clathrin-vermittelten endozytotischen Weg in die Zellen. Cryo-ET enthüllt die Pseudovirus-Morphologie und den Eintrittsmechanismus in Vero-E6-Zellen. Pseudovirusmembranen und ihre Segmentierung sind dunkelblau gefärbt. Spikes sind hellblau gefärbt. Clathrin-Triskelette sind orange gefärbt, endolysosomale Membranen violett. Alle virtuellen Scheiben sind 12 nm dick. Alle Maßstabsbalken = 100 nm. (a) Schnitt durch ein Tomogramm, das ein Pseudovirus zeigt. SARS-CoV-2-Spikes sind eindeutig identifizierbar. Die Pseudoviren tragen eine deutliche strukturelle Signatur, die durch das MLV-Kapsidgitter auferlegt wird. Die Insekten zeigen die rippenartige Struktur in einem Rohschnitt (links) und nach Mittelung außerhalb (Mitte) und innerhalb (rechts) der Zelle. (b) Schnitt durch eine Region der Wechselwirkung zwischen Zellplasmamembran und einem Pseudovirus. Die Zellregion, goldfarben, zeigt Aktinfilamente, die parallel zur Plasmamembran verlaufen. Der Einschub zeigt eine Nahaufnahme mit gelben Pfeilspitzen, die auf Verbindungen zwischen der Membran und den SARS-CoV-2-Spikes des Pseudovirus zeigen. (c) Oberflächendarstellung eines Pseudovirus im Prozess des Eindringens, befestigt an einer Clathrin-beschichteten Grube. Als Referenz für SARS-CoV-2 ist ein Schnitt des darunter liegenden Tomogramms im Hintergrund eingeblendet. (d) Oberflächendarstellung eines SARS-CoV-2-Pseudovirus in einem Clathrin-beschichteten Vesikel. Als Referenz wird eine Schicht des darunter liegenden Tomogramms in den Hintergrund eingeblendet. (e) Oberflächendarstellung eines endolysosomalen Kompartiments, das mehrere Pseudoviren enthält. Ein Schnitt des darunterliegenden Tomogramms wird als Referenz gezeigt und stellt mehrere beladene Vesikel und gewundene Membranstrukturen dar. (f) Schematische Darstellung des SARS-CoV-2-Pseudovirus-Eintritts und der nachfolgenden Schritte, die zu Luciferase-Signalen führen. Pseudoviren binden hACE2-Rezeptoren über ihre SARS-CoV-2-Spikes auf der Zelloberfläche (b), was eine Endozytose auslöst (c, d). Einmal drinnen, werden diese Pseudoviren auf das endolysosomale System (lila, e) gerichtet, was die Freisetzung von Luciferase-mRNA ermöglicht.

Die Forscher fanden heraus, dass hACE2-Nanopartikel den Eintritt von Pseudoviren bei MLVs mit WT-S-Protein um 97,6 %, bei MLVs mit Delta-S-Protein um 97,4 % und bei Pseudotyp-MLVs mit Omicron-S-Protein um 99,4 % verringerten. Darüber hinaus zeigte das Team, dass die Unterdrückung des Eintritts mit hACE2-Nanopartikeln effizienter war als die Verwendung von löslichem hACE2. Darüber hinaus bewerteten sie die Wirkung von hACE2-Nanopartikeln auf die Replikationskinetik von SARS-CoV-2 Delta unter Verwendung von Ex-vivo-Explantatkulturen von menschlichem Bronchusgewebe. Beobachtungen zeigten, dass die virale Replikation an der Nachweisgrenze aufgehoben wurde.

Die kryogene Elektronentomographie von hACE2-Nanopartikeln zeigt ihre Wechselwirkung mit SARS-CoV-2-Pseudoviren. Alle virtuellen Schnitte in dieser Abbildung sind 12 nm dick.  Balken in Haupttafeln = 50 nm;  Balken bei Insekten = 20 nm.  (a) Schnitt durch ein Tomogramm eines hACE2-Nanopartikels, das eine dichte Dekoration mit hACE2-Dimeren zeigt.  Die Einschübe zeigen den zweidimensionalen Mittelwert der aus den Nanopartikeln herausragenden Proteindichte (links) und die Überlagerung mit der Oberflächendarstellung (grün) der dreidimensionalen (3D) Rekonstruktion der membrangebundenen Partikel (rechts).  (b) Oberflächendarstellung der 3D-Rekonstruktion, die durch Subtomogramm-Mittelung von membrangebundenen Partikeln erhalten wurde (erweiterte Daten, Abbildung 2).  Die Atomstruktur des ACE2-Dimers (Monomere in Gelb und Rot), extrahiert aus der offenen Konformation des hACE2-B0AT1-Komplexes (PDB: 6MD1), wurde in die Dichte eingepasst, was eine gute Übereinstimmung zeigt.  (c) Virtueller Schnitt durch ein Tomogramm von hACE2-Nanopartikeln, die mit SARS-CoV-2-Pseudoviren interagieren.  Wechselwirkungen zwischen hACE2 und Spikes sind mit gelben Pfeilspitzen markiert.  Einschübe zeigen Nahaufnahmen von Wechselwirkungen zwischen hACE2-Nanopartikeln und Spikes, die durch die gelben Pfeilspitzen markiert sind.

Die kryogene Elektronentomographie von hACE2-Nanopartikeln zeigt ihre Wechselwirkung mit SARS-CoV-2-Pseudoviren. Alle virtuellen Schnitte in dieser Abbildung sind 12 nm dick. Balken in Haupttafeln = 50 nm; Balken bei Insekten = 20 nm. (a) Schnitt durch ein Tomogramm eines hACE2-Nanopartikels, das eine dichte Dekoration mit hACE2-Dimeren zeigt. Die Einschübe zeigen den zweidimensionalen Mittelwert der aus den Nanopartikeln herausragenden Proteindichte (links) und die Überlagerung mit der Oberflächendarstellung (grün) der dreidimensionalen (3D) Rekonstruktion der membrangebundenen Partikel (rechts). (b) Oberflächendarstellung der 3D-Rekonstruktion, die durch Subtomogramm-Mittelung von membrangebundenen Partikeln erhalten wurde (erweiterte Daten, Abbildung 2). Die Atomstruktur des ACE2-Dimers (Monomere in Gelb und Rot), extrahiert aus der offenen Konformation des hACE2-B0AT1-Komplexes (PDB: 6MD1), wurde in die Dichte eingepasst, was eine gute Übereinstimmung zeigt. (c) Virtueller Schnitt durch ein Tomogramm von hACE2-Nanopartikeln, die mit SARS-CoV-2-Pseudoviren interagieren. Wechselwirkungen zwischen hACE2 und Spikes sind mit gelben Pfeilspitzen markiert. Einschübe zeigen Nahaufnahmen von Wechselwirkungen zwischen hACE2-Nanopartikeln und Spikes, die durch die gelben Pfeilspitzen markiert sind.

Die Wechselwirkungen von hACE2-Nanopartikeln und Pseudoviren von SARS-CoV-2 wurden mittels Kryo-ET-Analyse charakterisiert. Strukturell stimmten die hochdichten Partikel, die aus der MLV-Membran herausragten, mit den in die Membran eingebetteten dimeren Strukturen von ACE2 überein. Interaktionen zwischen hACE2-Nanopartikeln und S-Typ-Pseudoviren wurden durch Interaktionen zwischen hACE2-Dimeren (von Ködern) und Präfusions-S-Protein (von Pseudoviren) erleichtert.

Schlussfolgerungen

Die aktuellen Ergebnisse zeigten, dass hACE2-Nanopartikel eine Vero-E6-Zellinfektion durch SARS-CoV-2-Pseudoviren effizient verhindern. Darüber hinaus wurde die Infektion von Ex-vivo-Kulturen von Bronchusgeweben durch lebendes SARS-CoV-2 verhindert, indem hACE2-Nanopartikel mit zellulärem ACE2 konkurrierten und ACE2 auf demselben Nanopartikel vernetzten, das mit mehreren Viren in Kontakt kam.

Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Nanopartikel von hACE2 als effiziente und potente Köder mit robuster Neutralisierung des Zelleintritts wirken könnten, was eine nächste Generation therapeutischer Interventionen darstellt, die weniger anfällig für virale Fluchtmechanismen sind als verfügbare Strategien.

* Wichtiger Hinweis

bioRxiv veröffentlicht vorläufige wissenschaftliche Berichte, die keinem Peer-Review unterzogen wurden und daher nicht als schlüssig angesehen werden sollten, die klinische Praxis / gesundheitsbezogenes Verhalten leiten oder als etablierte Informationen behandelt werden sollten.

Zeitschriftenreferenz:

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