Untersuchung der Rolle von Cyclinen und Cyclin-abhängigen Kinasen bei der Wirtsrestriktion einer SARS-CoV-2-Infektion

In einer kürzlich veröffentlichten Studie bioRxiv* Pre-Print-Server, Forscher untersuchten die durch die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) ausgelöste Veränderung der Werte von Cyclinen und Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs) in den Wirtszellen.

Studien: Zellzyklusunabhängige Rolle von Cyclin D3 bei der Wirtsrestriktion einer SARS-CoV-2-Infektion. Bildnachweis: 3DJustincase / Shutterstock

Sowohl Cycline als auch CDKs sind Schlüsselregulatoren des Wirtszellzyklus. Viele Coronaviren (CoVs), einschließlich des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), verlagern und bauen Cycline innerhalb der Wirtszellen ab, um sich effizient zu replizieren.

Eine kürzlich durchgeführte Studie, in der phosphoproteomische Profile von SARS-CoV-2-infizierten VERO-E6-Zellen untersucht wurden, ergab, dass SARS-CoV-2 die CDK1- und CDK2-Aktivitäten verringerte. Auf diese Weise halten Viren den Wirtszellzyklus während der Phase der Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Synthese (S) und der Zellwachstumsphase (G2) an.

Es ist bemerkenswert, dass pathogene Viren von Wirtszellen synthetisierte Nukleotide für ihre Replikation verwenden. Indem sie den Zellzyklusarrest des Wirts anhalten, erhöhen sie außerdem DNA-Reparaturprozesse und Replikationsproteine, die für die virale Replikation entscheidend sind.

Über das Studium

In der vorliegenden Studie sammelten die Forscher umfangreiche Daten zu SARS-CoV-2-Zellzyklusveränderungen unter Verwendung von VERO- und A549-Alveolarzellen vom Typ II (AT2).

Sie verwendeten Immunfluoreszenz, um die zelluläre Verteilung der Cycline D1, D3 und A2 in infizierten VERO AT2-Zellen zu analysieren. Die Fluoreszenzintensität spiegelte das Verhältnis von Kern und Zytoplasma (N/C) von Cyclinen in nicht infizierten und infizierten Zellen wider. Darüber hinaus maßen die Forscher die D-Cyclin-Spiegel in infizierten Zellen in Abwesenheit oder Anwesenheit von Protease-Inhibitoren, Carbobenzoxy-Leu-Leu-Leucinal (MG-132) und Bortezomib.

Die kleine interferierende RNA (siRNA) reduziert die Cyclin D- und A2-Spiegel 48 Stunden nach der Transfektion in A549-AT2-Zellen um mehr als 80 % im Vergleich zu nicht zielgerichteten Kontrollen. Die an Cyclin verarmten Zellen wurden mehrfach Delta-, Alpha- und Wildtyp-SARS-CoV-2-Varianten ausgesetzt, um die funktionelle Rolle von D-Cyclinen in der SARS-CoV-2-Pathogenese zu untersuchen.

Das Team verwendete den Fluoreszenz-Ubiquitinations-Zellzyklus-Indikator (FUCCI) (oder Sensor) in VERO- und A549-AT2-Zellen, um den Phänotyp des Zellzyklusarrests zu untersuchen. Schließlich verwendeten sie Durchflusszytometrie, um G1, frühe S-, S-, G2- und mitotische (M) Phasen zu visualisieren.

Studienergebnisse

Die Studienergebnisse zeigten, dass die SARS-CoV-2-Infektion die Translokation von Cyclin D1 und Cyclin D3 aus dem Wirtszellkern in das Zytoplasma für den Proteasomabbau auslöste und dessen Zusammenbau und Freisetzung neu produzierter Virionen wiederherstellte.

Die Fucci-Sensor-Expression half den Forschern, das N/C-Verhältnis der D-Cyclin-Färbung in verschiedenen Zellzyklusphasen zu quantifizieren. Die Ergebnisse zeigten, dass Cyclin D3 und Cyclin D1 in SARS-CoV-2-infizierten Zellen unabhängig von der Zellzyklusphase zum Abbau vom Zellkern in das Zytoplasma verlagert wurden. Interessanterweise induzierte SARS-CoV-2 nur den Abbau des Cyclin-D-Proteins. Dementsprechend zeigte die Analyse anderer Cycline in VERO AT2-Zellen keine Veränderungen an den Cyclinen A, B oder E.

Cyclin A fördert den Eintritt in die S-Phase und die Mitose, Cyclin B reichert sich in der Zellwachstumsphase (G2) an und Cyclin E verhindert den Eintritt in die S-Phase. Außerdem scheinen die spezifischen Zellzyklusphasen, in denen Zellen arretiert werden, vom Zelltyp abhängig zu sein.

Bei verminderten Cyclin-D1- und Cyclin-D3-Spiegeln arretiert der Wirtszellzyklus in der G1-Phase, nicht in der S/G2-Phase. In Abwesenheit von Cyclin Ds wurden A549-AT2-Zellen in der frühen S-Phase und VERO-AT2-Zellen in der S/G2- oder M-Phase angehalten, was auf die Rolle anderer Faktoren beim Zellzyklusarrest während COVID-19 hinweist.

Bemerkenswert ist, dass Cyclin-D-Proteine ​​während COVID-19 in allen Zellzyklusphasen immer vom Zellkern zum Zytoplasma relokalisiert und abgebaut wurden. Umgekehrt änderten sich die Expressionsniveaus von CDKs nicht. Die Autoren glaubten, dass der Phosphorylierungszustand von CDKs das Fortschreiten des Zellzyklus beeinflusst haben könnte; die vorliegende Studie untersuchte diesen Effekt jedoch nicht.

SARS-CoV-2 benötigt M-, E- und Nukleokapsid (N)-Proteine ​​für die Virion-Assemblierung in den Zisternen des endoplasmatischen Retikulums (ER) -Golgi-Zwischenkompartiments. Die Autoren stellten die Rolle von Cyclin D3 bei der Ausbreitung von SARS-CoV-2 und der fehlerhaften Virusassemblierung fest. Noch wichtiger ist, dass es sich als neuer Interaktor mit SARS-CoV-2-Hüllprotein (E) und sogar Membranprotein (M) herausstellte.

Cyclin D3 assoziiert mit dem SARS-CoV-2 M-Protein, um den Zusammenbau und die Ausbreitung von SARS-CoV-2 zu beeinträchtigen. Umgekehrt behalten Wirtszellen das SARS-CoV-2-Spike (S)-Protein in Gegenwart von M und E; seine Translokation in Richtung der Membran und seine Fähigkeit, Syncytien zu bilden, nimmt jedoch aufgrund von Cyclin D3 ab. Die Daten stützen die Hypothese, dass Cyclin D3 ein Restriktionsfaktor ist, der die Rolle von M und E während der SARS-CoV-2-Assemblierung behindert.

Schlussfolgerungen

Die Studie hob hervor, wie Cyclin-D-Proteine ​​mit den E- und M-Proteinen von SARS-CoV-2 interferieren, um eine effiziente virale Assemblierung und Replikation zu beeinträchtigen. Daher hat SARS-CoV-2 Strategien zum Abbau von Cyclin D3 für eine effizientere Virion-Assemblierung und -Replikation entwickelt. Dieses entscheidende Phänomen muss umfassend über alle SARS-CoV-2-Varianten hinweg untersucht werden, um ein universelles antivirales Angriffsziel gegen SARS-CoV-2 zu entwickeln.

* Wichtiger Hinweis

bioRxiv veröffentlicht vorläufige wissenschaftliche Berichte, die nicht von Fachleuten begutachtet wurden und daher nicht als schlüssig angesehen werden sollten, die klinische Praxis / gesundheitsbezogenes Verhalten leiten oder als etablierte Informationen behandelt werden sollten.

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