Verwendung von PCR-basierter Genotypisierung zum Nachweis einer SARS-CoV-2-Delta-Omicron-Koinfektion

In einem kürzlich erschienenen „Letter to the Editor“ in der Zeitschrift Mikrobiologisches Spektrumhaben Wissenschaftler das Verfahren der auf Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierenden Genotypisierung zur Identifizierung einer Delta-Omicron-Koinfektion in klinischen Proben beschrieben.

Studien: Identifizierung von Omicron-Delta-Koinfektionen mittels PCR-basierter Genotypisierung. Bildnachweis: NIAID

Hintergrund

Die zuletzt aufgetauchte Omicron-Variante des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) hat weltweit zu einem starken Anstieg der Fälle der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) geführt. Ein stark mutiertes Spike-Protein ist für eine deutlich erhöhte Übertragbarkeit und Immunausweichfähigkeit verantwortlich. Die Omicron-Variante wurde erstmals am 24. November 2021 in Südafrika entdeckt und wurde bald weltweit vorherrschend. Trotz hoher Übertragbarkeit und Infektiosität verursacht die Variante jedoch meist leichte bis mittelschwere Infektionen.

Vor dem Aufkommen der Omicron-Variante war die Delta-Variante von SARS-CoV-2 überwiegend in den USA im Umlauf und war für mehr als 99 % aller nachgewiesenen COVID-19-Fälle verantwortlich. Während der Delta-Welle gab es in den USA über 100.000 Fälle pro Tag. Im Gegensatz zu Omicron-Infektionen sind Delta-Infektionen mit einer hohen Morbidität und Mortalität verbunden.

In vielen Ländern auf der ganzen Welt, einschließlich den USA, wurden COVID-19-Fälle mit Delta-Omicron-Koinfektionen festgestellt. Die Sequenzierungsanalyse des gesamten Genoms hat das Vorhandensein sowohl einer Delta- als auch einer Omicron-Infektion bestätigt. Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass jede der Varianten die andere Variante im Verlauf der dualen Infektion übertreffen kann.

In der aktuellen Studie haben Wissenschaftler das Verfahren zum Nachweis von Delta-Omicron-Konfekt in klinischen Proben mithilfe eines PCR-basierten Genotypisierungspanels beschrieben.

Sie haben die Koinfektion in vier Proben nachgewiesen. In zwei Proben haben sie eine digitale PCR mit reverser Transkription und Tröpfchen und zwei unterschiedliche Amplikon-basierte Sequenzierungsmethoden angewendet, um Delta-Omicron-Koinfektionen zu identifizieren. Sie haben zwei separate Runden der Hybrid-Capture-Sequenzierung in den anderen beiden Proben durchgeführt, um Koinfektionen zu identifizieren.

Verfahren zur Identifizierung einer Delta-Omicron-Koinfektion

Die Wissenschaftler extrahierten RNAs aus insgesamt 10.000 zufällig ausgewählten klinischen Proben mit RT-PCR-bestätigten SARS-CoV-2-Infektionen. Um zwischen den Delta- und Omicron-Varianten zu unterscheiden, wählten sie vier spezifische genomische Ziele (G8393A, T13195C, C21618G, C23202A) aus und führten eine Allel-spezifische PCR durch, um die Ziele nachzuweisen. In vier von 10.000 getesteten Proben beobachteten sie mittlere Amplifikationsniveaus für beide Allele auf allen vier Zielen. Dies weist auf die Möglichkeit einer Delta-Omicron-Koinfektion hin.

In zwei von vier Proben mit möglichen Koinfektionen führten sie einen weiteren PCR-Assay durch, um das Versagen des Spike-Gen-Targets zu erkennen, und einen digitalen RT-Tröpfchen-PCR-Assay, der auf vier verschiedene Spike-Genloci abzielte (417K, 452L, 484E und 501N). Darüber hinaus verwendeten sie das Swift Normalase Amplicon Panel (SNAP), um in diesen beiden Proben eine Gesamtgenom-Sequenzierungsanalyse durchzuführen. Der SNAP bietet eine robuste Sequenzierungsplattform für die vollständige Abdeckung des viralen Genoms und den Nachweis subgenomischer RNA.

Die Gesamtgenomsequenzierung identifizierte virale Genome, die spezifisch für Delta-Linien sind. Darüber hinaus wurde in den Proben kein Spike-Gen-Target-Versagen festgestellt. Die Minor-Allele (das zweithäufigste Allel an einem genetischen Locus), die Omicron-spezifischen Mutationen entsprechen, wurden jedoch mit einer Häufigkeit von 5 % bis 40 % nachgewiesen. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse der digitalen RT-Tröpfchen-PCR auch allelspezifische Tröpfchen in allen vier Zielorten mit einer Häufigkeit von 18 % bis 34 %. Diese Befunde weisen weiter auf das Vorhandensein einer Koinfektion hin.

Der Hauptvorteil des digitalen PCR-Tröpfchens ist die umfassende Aufteilung der Probe. Das Verfahren basiert auf der Wasser-Öl-Emulsionströpfchentechnologie. Die interessierende Probe wird in mehrere Tröpfchen aufgeteilt, und in jedem Tröpfchen erfolgt eine PCR-vermittelte Amplifikation der Zielsequenzen.

In den anderen beiden Proben wurde eine Delta-Omicron-Koinfektion unter Verwendung derselben allelspezifischen PCR identifiziert. Diese Proben wurden zwei Hybrid-Capture-Sequenzierungsrunden unterzogen, um die Allelhäufigkeiten zu bestätigen. Insgesamt deuten die Ergebnisse stark auf das Vorhandensein einer Koinfektion hin.

Signifikanzstudien

Die Studie unterstreicht die Bedeutung der PCR-basierten Genotypisierung für die schnelle Identifizierung von Delta-Omicron-Koinfektionen in klinischen Proben. Aus kanonischen Genomsequenzen ist es schwierig, Koinfektionen zu identifizieren.

Aufgrund der hohen Gemeinschaftsübertragung verschiedener Virusvarianten wird die Prävalenz von Koinfektionen wahrscheinlich im Laufe der Zeit zunehmen. Die Identifizierung einer Koinfektion ist besonders wichtig, da eine anhaltende Doppelinfektion durch zwei unterschiedliche Varianten zu einer Kombination von genetischem Material und der anschließenden Entstehung rekombinanter Varianten führen kann.

Zeitschriftenreferenz:

  • Identifizierung von Omicron-Delta-Koinfektionen mittels PCR-basierter Genotypisierung Pavitra Roychoudhury ,, Shishi Luo, Kathleen Hayashibara, Pooneh Hajian, Margaret G. Mills, Jean Lozach, Tyler Cassens, Seffir T. Wendm, Isabel Arnould, David Becker, Tim Wesselman, Tim Wesselman, Davis-Turak, Richard Creager, Eric Lai, Keith R. Jerome, Tracy Basler, Andrew Dei Rossi, William Lee, Alexander L. Greninger, https://journals.asm.org/doi/epub/10.1128/spectrum.00605-22

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